ВведениеБолезни рыб вирусной этиологии широко распространены во всём мире. Около четверти выявленных вирусов вызывают заболевания, наносящие серьезный ущерб объектам аквакультуры и морским гидробионтам [6]. Несмотря на то, что большинство инфекций не представляют прямой угрозы здоровью человека, они отрицательно влияют на темп роста рыб, товарный вид, качество рыбопродукции, а также сопровождаются высокой летальностью [1].Во всем мире главное направление в борьбе с заразными болезнями рыб – профилактика, а именно – предотвращение проникновения патогенов в регионы, где их прежде не было [5]. Из этого следует, что завоз рыбопосадочного материала в Россию из стран с различной эпизоотологической ситуацией требует мониторинга и прогнозирования на основе возможных рисков.В комплексе мероприятий по предотвращению распространения вирусных инфекций рыб ведущее место отводится диагностике. На сегодняшний день лабораторная диагностика заболеваний основана на выделении вируса и его идентификации серологическими методами, которые требуют больших затрат времени и выполняются только в крупных научно-исследовательских институтах, имеющих профильные лаборатории [5; 6].В последние годы всё более важными инструментами для диагностики инфекционных болезней становятся методы молекулярно-генетического анализа, в том числе различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием.Молекулярные методы диагностики более чувствительны и требуют меньше времени, чем культивирование и серологические методы, традиционно используемые для идентификации вирусов рыб. В течение последних 15 лет молекулярная диагностика заболеваний значительно продвинулась, в том числе и при выявлении заболеваний рыб. К числу таких методов относится ПЦР и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), которые позволяют обнаружить вирус у рыб, как с явными клиническими признаками, так и у рыб со скрытым вирусоносительством [2; 4].В России отсутствуют методы, сочетающие невысокую стоимость анализа, простоту в использовании, а главное, высокую чувствительность. На отечественном рынке предлагаются только импортные наборы и тест-системы для диагностики вирусных болезней рыб. Таким образом, целью настоящего исследования являлась оценка возможности применения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для индикации и идентификации таких особо опасных возбудителей вирусных болезней рыб семейства лососёвых, как вирусная геморрагическая септицемия (VHSV, viral haemorrhagic septicaemia virus), инфекционный некроз гемопоэтической ткани (IHNV, infectious haematopoietic necrosis virus), инфекционная анемия (ISAV, infectious salmon anaemia virus) и инфекционный панкреатический некроз (IPNV, infectious pancreatic necrosis virus). Материалы и методыВ качестве стандартных референтных образцов были использованы следующие штаммы: «Аркус 32/87» вируса IHNV, «FLD/2004» вируса IPNV, «Аланд» вируса VHSV, находящиеся на хранении во «Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)», а также штамм «CCBB» вируса ISAV, полученный в 2019 г. из Американской коллекции типовых культур (ATCC).Выделение РНК исследуемых вирусов проводили с использованием комплекта реагентов «РИБО-сорб» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия), согласно инструкции производителя. Для получения кДНК на матрице, выделенной РНК, использовали комплект реагентов «ОТ-1» (ООО «НПФ Синтол», Россия), согласно рекомендациям фирмы-производителя. Реакционную смесь для постановки ПЦР готовили в объёме 25 мкл с использованием набора реактивов «Encyclo Plus PCR kit» (ЗАО «Евроген», Россия), согласно инструкции к набору. ПЦР проводили в термоциклере «PTC-200 DNA Engine Cycler» (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Последовательности олигонуклеотидных праймеров, используемых для постановки ПЦР, заимствованы из работ Н.Ю. Кандриной и др., 2014 [8], M. Devold et al., 2000 [9], E.J. Emmenegger et al., 2000 [11] и P. Vennerström et al., 2018 [17]. Олигонуклеотиды были синтезированы в компании ООО «НПФ Синтол».Полученные в ходе ПЦР ампликоны анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (10 мг/мл) в течение 1 часа при напряжении 10 V/см в 1х трисборатном буфере. В качестве маркера молекулярных весов использовали «M100» с шагом в 100 п.н. (ООО «НПФ Синтол», Россия) в количестве 5 мкл. По окончании электрофореза гель анализировали в коротковолновом УФ-свете (длина волны 312 нм с помощью системы гель-документирования «Взгляд» (ООО «НПФ Хеликон», Россия) и результаты реакции интерпретировали по наличию или отсутствию светящихся полос.Аналитическую чувствительность оценивали путём исследования серии последовательных десятикратных разведений суспензий культуральных штаммов «Аркус 32/87» вируса IHNV, «FLD/2004» вируса IPNV, «Аланд» вируса VHSV и «CCBB» вируса ISAV с исходными титрами инфекционной активности, соответственно, 6,90 lg ТЦД50/см3, 5,77 lg ТЦД50/см3, 7,20 lg ТЦД50/см3 и 5,50 lg ТЦД50/см3. Пределом чувствительности считали наибольшее разведение, при котором регистрировали положительный результат. Результаты и обсуждениеНа основании проведённого анализа последовательностей генома исследуемых вирусов IHNV, IPNV, VHSV и ISAV, представленных в базе данных GenBank Национального центра биотехнологической информации США (National Center for Biotechnological Information, NCBI) и рекомендаций Всемирной организации по охране здоровья животных (World Organisation for Animal Health, OIE) [14], нами были выбраны олигонуклеотиды к консервативным участкам 8-го сегмента вируса ISAV, нуклеокапсида (N) вируса VHSV, гена G вируса IHNV и сегмента B вируса IPNV, позволяющих идентифицировать максимальное количество известных штаммов и изолятов этих вирусов. Последовательности олигонуклеотидов представлены в таблице 1. Таблица 1. Структура олигонуклеотидов для выявления возбудителей ISAV, VHSV, IHNV и IPNVTable 1. Structure of oligonucleotides for the detection of pathogens ISAV, VHSV, INV and INVВозбудительПоследовательность (5΄-3΄) олигонуклеотидовРазмер ПЦР продукта, п.н.ИсточникISAVF – GAAGAGTCAGGATGCCAAGACG211M. Devold et al., 2000 [9]R – GAAGTCGATGAACTGCAGCGAVHSVF – GGGGACCCCAGACTGT811P. Vennerström et al., 2018 [17]R – TCTCTGTCACCTTGATCCIHNVF – AGAGATCCCTACACCAGAGAC693E.J. Emmenegger et al., 2000 [11]R – GGTGGTGTTGTTTCCGTGCAAIPNVF - ACGTTGGTGGCACCCGACATAC860Н.Ю. Кандрина и др., 2014 [8]R - GTGTCTCCTTTGGTTTTGCCTATGПримечание: F – forward (прямой олигонуклеотидный праймер), R – reverse (обратный олигонуклеотидный праймер) В серии экспериментов были подобраны температурные и временные условия постановки ПЦР. При амплификации фрагмента генома вируса IHNV количество циклов было увеличено с 30 до 35, что позволило наработать большее число ампликонов, тем самым увеличилась чувствительность реакции. При амплификации фрагмента генома вируса ISAV время отжига олигонуклеотидов было уменьшено с 45 сек до 30 сек, а синтеза – с 90 сек до 60 сек, что позволило сократить время реакции без потери её эффективности. При амплификации фрагмента генома вируса IPNV был убран второй раунд постановки ПЦР, предложенный Н.Ю. Кандриной с соавт. [8], что также позволило сократить время реакции. При амплификации фрагмента генома вируса VHSV температура отжига олигонуклеотидов была увеличена с 52°С до 55°С, что позволило усилить специфичность реакции.Оптимизированные параметры амплификации для исследуемых инфекций представлены в таблице 2. Таблица 2. Параметры амплификации для выявления возбудителей ISAV, VHSV, IHNV и IPNVTable 2. Amplification parameters for the detection of ISAV, VHSV, INV and INV pathogensСтадия ПЦРКоличество цикловТемпература, °СДлительность стадии, мин.Предварительная денатурация1953Денатурация35951/2Отжиг праймеров59 (ISAV); 50 (IHNV);55 (VHSV); 57 (IPNV)1/2Синтез721Заключительный синтез1727Хранение1420 Специфичность выбранных олигонуклеотидов была проверена экспериментально при исследовании культур клеточных линий ASK (культура клеток головной почки атлантического лосося), RTG-2 (культура клеток гонад радужной форели), EPC (культура клеток папулезной эпителиомы карпа) и CHSE-214 (культура клеток эмбриона чавычи) после инокуляции вирусами, соответственно, ISAV, VHSV, IHNV и IPNV в ОТ-ПЦР. Полученные после амплификации фрагменты геномов данных вирусов анализировали с помощью гель-электрофореза.На рисунке 1 представлены электрофореграммы проведённого анализа. A.     B. C.     D. Рисунок 1. Электрофореграммы результатов тестирования специфичности метода ОТ-ПЦР для выявления вирусов IHNV (A.), ISAV (B.), VHSV (C.) и IPNV (D.):Figure 1. Electrophoregram of the results of testing the specificity of the RT-PCR method for detecting viruses IHNV (A.), ISAV (B.), VHSV (C.) and IPNV (D.):A.     дорожка 1 – маркер молекулярных весов «M100»;   дорожка 2 – штамм «Аркус 32/87» вируса IHNV;   дорожка 3 – штамм «Аланд» вируса VHSV;   дорожка 4 – штамм «FLD/2004» вируса IPNV;   дорожка 5 – штамм «CCBB» вируса ISAV;   дорожка 6 – отрицательный контроль (стерильная вода, свободная от РНКаз и ДНКаз).B.     дорожка 1 – маркер молекулярных весов «M100»;   дорожка 2 – штамм «CCBB» вируса ISAV;   дорожка 3 – штамм «Аланд» вируса VHSV;   дорожка 4 – штамм «Аркус 32/87» вируса IHNV;   дорожка 5 – штамм «FLD/2004» вируса IPNV;   дорожка 6 – отрицательный контроль (стерильная вода, свободная от РНКаз и ДНКаз).C.     дорожка 1 – маркер молекулярных весов «M100»;   дорожка 2 – штамм «Аланд» вируса VHSV;   дорожка 3 – штамм «FLD/2004» вируса IPNV;   дорожка 4 – штамм «Аркус 32/87» вируса IHNV;   дорожка 5 – штамм «CCBB» вируса ISAV;   дорожка 6 – отрицательный контроль (стерильная вода, свободная от РНКаз и ДНКаз).D.     дорожка 1 – маркер молекулярных весов «M100»;   дорожка 2 – штамм «FLD/2004» вируса IPNV;   дорожка 3 – штамм «Аланд» вируса VHSV;   дорожка 4 – штамм «Аркус 32/87» вируса IHNV;   дорожка 5 – штамм «CCBB» вируса ISAV;   дорожка 6 – отрицательный контроль (стерильная вода, свободная от РНКаз и ДНКаз).Из представленных на рисунке 1 данных видно, что в лунках №2 со штаммами вирусов IHNV, ISAV, VHSV и IPNV наблюдаются чёткие фрагменты на уровне 693 п.н. (A.), 211 п.н. (B.), 811 п.н. (C.) и 860 п.н. (D.), соответственно. В остальных лунках, включая отрицательный контроль реакции, данные фрагменты не наблюдаются, что свидетельствовало о высокой специфичности подобранных олигонуклеотидов для выявления возбудителей рассматриваемых инфекций и отсутствии контаминации используемых реагентов, исследуемой или посторонней РНК.Аналитическую чувствительность оценивали путём исследования серии последовательных десятикратных разведений культуральных штаммов «CCBB» вируса ISAV, «Аланд» вируса VHSV, «Аркус 32/87» вируса IHNV и «FLD/2004» вируса IPNV, с исходным титром их инфекционной активности – 5,50 lg ТЦД50/см3, 7,20 lg ТЦД50/см3, 6,90 lg ТЦД50/см3 и 5,77 lg ТЦД50/см3, соответственно. Пределом чувствительности считали наибольшее разведение, при котором регистрировали положительный результат. Рассчитанные значения аналитической чувствительности оптимизированной ПЦР составили 2,50 lg ТЦД50/см3 для вируса ISAV, 2,90 lg ТЦД50/см3 для вируса IHNV, 4,20 lg ТЦД50/см3 для вируса VHSV и 2,77 lg ТЦД50/см3 для вируса IPNV.Результаты тестирования аналитической чувствительности представлены на рисунке 2 и в таблице 3. A.     B. C.     D. Рисунок 2. Электрофореграммы результатов определения аналитической чувствительности ПЦР для выявления геномов вирусов ISAV (A.), IPNV (B.), VHSV (C.) и IHNV (D.):Figure 2. Electrophoregram of the results of determining the analytical sensitivity of PCR for detecting the genomes of ISAV (A.), IPNV (B.), VHSV (C.) and IHNV (D.) viruses:дорожка 1 – маркер молекулярных весов «M100»;дорожка 2 – исходный образец штамма «CCBB» вируса ISAV (A.), штамма «FLD/2004» вируса IPNV (B.), штамма «Аланд» вируса VHSV (C.) и штамма «Аркус 32/87» вируса IHNV (D.);дорожки с 3-ю по 7-ю – серия десятикратных разведений (10-1 – 10-5) культуральных штаммов «CCBB», «FLD/2004», «Аланд» и «Аркус 32/87»;дорожка 8 – отрицательный контроль (стерильная вода, свободная от РНКаз и ДНКаз). Таблица 3. Результаты определения аналитической чувствительности, оптимизированной ПЦРTable 3. Results of determination of analytical sensitivity optimized by PCRВозбудительРазведениеТитр инфекционной активности вируса, lg ТЦД50/см3Результат ПЦРISAVисходный образец5,50+10-14,50+10-23,50+10-32,50+10-41,50-10-50,50-IHNVисходный образец6,90+10-15,90+10-24,90+10-33,90+10-42,90+10-51,90-VHSVисходный образец7,20+10-16,20+10-25,20+10-34,20+10-43,20-10-52,20-IPNVисходный образец5,77+10-14,77+10-23,77+10-32,77+10-41,77-10-50,77-Примечание: «+» – положительный результат реакции; «-» – отрицательный результат реакции Таким образом, предложенный метод ОТ-ПЦР позволяет выявлять вирусы ISAV, IHNV, VHSV и IPNV со следующими титрами инфекционной активности – 2,50 lg ТЦД50/см3, 2,90 lg ТЦД50/см3, 4,20 lg ТЦД50/см3 и 2,77 lg ТЦД50/см3, соответственно. Специфичность подобранных олигонуклеотидов была проверена с помощью онлайн программы BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), а также экспериментально. Результаты ОТ-ПЦР, представленные на рисунке 1, показали, что выбранные олигонуклеотиды гибридизируются только с фрагментами генома комплементарными искомым вирусам и не взаимодействуют с РНК других вирусов.С помощью описанного метода была проведена идентификация штаммов, референтных и полевых, имеющихся в референтной лаборатории по болезням аквакультуры ФГБУ «ВНИИЗЖ». Данные, полученные в ходе исследований с применением ОТ-ПЦР, корректировали с результатами, полученными методом вирусовыделения в чувствительных культурах клеток и методом иммуноферментного анализа, с использованием коммерческих наборов фирм-производителей «TestLine Clinical Diagnostics Ltd» (Чехия) и «Bio-X Diagnostics S.A.» (Бельгия).Следующим этапом работ в данном направлении будет разработка методик и подходов по обнаружению ISAV, VHSV, IHNV и IPNV с использованием современного и более чувствительного метода – ПЦР в режиме реального времени с последующим секвенированием и филогенетическим анализом вариабельных элементов генома выделенных изолятов перечисленных вирусов. Определение нуклеотидной последовательности вариабельных сегментов генома, обсуждаемых в статье возбудителей, позволит не только установить серотип вируса, но и определить другие его свойства, например, его топотип или географическое происхождение. Актуальность такого анализа связана со значительным уровнем генетической гетерогенности последовательностей изолятов различного географического происхождения, но принадлежащих к одному серотипу.Применение ПЦР в диагностике вирусных болезней рыб стимулирует развитие аква- и марикультуры за счёт увеличения разнообразия методических подходов для практической ветеринарии и представляет большой интерес для изучения молекулярно-генетических исследований свойств вирусов, циркулирующих в пресных водоёмах и прибрежных морских акваториях Российской Федерации.Отметим, что в нашей стране данные по использованию метода ПЦР в диагностике вирусных болезней рыб малочисленны. Имеется лишь ограниченное число публикаций [2; 3; 4; 7; 15] по разработке и использованию этого молекулярно-генетического метода, в то время, как за рубежом он получил широкое распространение. Во многих странах избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью ПЦР с последующим секвенированием используется не только в диагностики вирусов ISAV, VHSV, IHNV и IPNV, но и для разработки методов по их типированию [10; 12; 13; 16]. ЗаключениеВ результате проведённых исследований подобраны олигонуклеотиды и оптимизированы температурно-временные условия проведения ПЦР для выявления следующих особо опасных вирусных болезней рыб семейства лососёвых: ISAV, VHSV, IHNV и IPNV.Показано, что данный диагностический метод является высокоспецифичным и имеет аналитическую чувствительность 2,50 lg ТЦД50/см3 при выявлении вируса ISAV, 2,90 lg ТЦД50/см3 – IHNV, 4,20 lg ТЦД50/см3 – VHSV и 2,77 lg ТЦД50/см3 – IPNV. Постановка ОТ-ПЦР занимает в среднем 6 часов, в то время как «золотой стандарт» – вирусовыделения в чувствительных клеточных культурах занимает несколько недель – от 14 до 21 суток, что позволяет сократить время проведения анализа в 56-84 раза и существенно снизить финансовые затраты на проведение исследований.Предложенная ОТ-ПЦР может быть использована для выявления вирусов ISAV, VHSV, IHNV и IPNV в мониторинговых исследованиях проб патологического материала от рыб семейства лососёвых. Особенностью данной реакции является то, что она позволяет выявлять инфицированных рыб до появления клинических признаков, в случае скрытого вирусоносительства, что особенно важно при трансграничных перевозках гидробионтов.По результатам проведённых исследований были подготовлены и утверждены на учёном совете ФГБУ «ВНИИЗЖ» методические рекомендации по выявлению возбудителей VHSV (дата утверждения: 10.01.2019 т.), IHNV (дата утверждения: 10.01.2019 т.) ISAV (дата утверждения: 02.12.2019 г.) и IPNV (дата утверждения: 23.12.2020 т.) методом ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией.