Moscow State University of Technologies and Management (FCU) (Leading Researcher)
Russian Federation
Russian Federation
Russian Federation
UDK 639.3.07 Выращивание молоди в вырастных хозяйствах
BBK 472 Рыбное хозяйство
The paper considers the combined effect of ultraviolet radiation (UV) and ultrasonic cavitation (ultrasonic) as part of ultrasonic filtration systems on representatives of saprophytic and conditionally pathogenic microflora of water. Ultrasound examination (25 kHz) is a promising method of purification in aquaculture due to the possibility of inactivation of microorganisms in agglomerates that are not exposed to UV. As a result of the study of the cultivated microflora, it was found that ultraviolet radiation and the combined effect of UV and ULTRASOUND have a significant effect on the quantity and quality of saprophytic microflora of water. It is shown that the studied modes of operation led to a significant decrease (at p <0.05) in the occurrence of the genus Escherchia relative to the control (without exposure to ultrasound and UV). The total contamination of UV water decreased to 1.2×102 CFU/ml with UV operation and to 1.1×102 CFU/ml with the combined action of UV and ultrasound. The UV sterilizer showed low efficiency in relation to Enterobacter cloacae, while the combined effect of UV and ultrasound led to a significant decrease in CFU to 0.94 ± 0.05 Log10.
saprophytic water microflora, RAS, ultrasound, ultraviolet radiation
Введение
Выращивание гидробионтов в установках замкнутого водоснабжения (УЗВ) является одним из перспективных способов индустриальной аквакультуры [1], так как позволяет культивировать виды вне зависимости от климатических условий, снижает потребность в сырьевых и энергетических ресурсах, а также оказывает минимальное воздействие на окружающую среду [2].
Ключевой технологической особенностью УЗВ представляется оборотное водоснабжение бассейнов, при котором повторно используемая вода проходит ряд последовательных этапов очистки: механическая (удаление крупных взвесей, отстаивание, фильтрация), биологическая (использование быстро размножающихся гетеротрофных микроорганизмов для окисления органических биополимеров и перевода аммония в нитраты) и дезинфекция (обработка воды жестким ультрафиолетовым излучением и\или озонирование) [3].
Важным элементом системы очистки воды УЗВ является биофильтр, в котором формируется микробное сообщество, состоящее из представителей разных таксономических групп, включая нитрифицирующие бактерии, преобразующие ионы аммония в нитраты [4]. Формирование состава микробиома биофильтра и воды УЗВ не является универсальным и зависит от множества внешних факторов и, вероятно, уникально для каждой установки [5]. Так, состав микробиома биофильтра может подвергаться значительным вариациям, в результате изменения плотностей посадки и нормы кормления, температуры и гидрохимических параметров среды, а также применения химических терапевтических средств [6, 7]. Известно, что сапрофитная микрофлора – одна из ключевых экологических групп микроорганизмов в аквакультурных хозяйствах типа УЗВ [8, 9] и, как правило, она представлена видами типа Proteobacteria. В зависимости от условий, в биофильтре доминируют виды протеобактерий, которые могут участвовать в деструкции продуктов метаболизма гидробионтов (род Nitrosomonas и Nitrococcus) [10, 11], либо относится к условно-патогенной флоре (Aeromonas salmonicida, A. hydrophila, A. caviae, Pseudomonas fluorescens, сем. Enterobacteriaceae и др.), вызывающей различные заболевания у культивируемых объектов [12]. Поэтому в условиях плотных посадок гидробионтов, особое внимание уделяется применению дополнительных методов очистки и дезинфекции воды. Например, использование жесткого УФ-излучения является наиболее безопасным и дешёвым способом дезинфекции воды. При этом, эффективность воздействия УФ-радиации может снижаться при высоком содержании органических загрязнений и большого числа возвещённых частиц, к которым прикрепляются микроорганизмы [13]. Подобные стабильные агломераты (лишь частично подверженные биоцидному действию УФ) известны для колониальных и спорообразующих микроорганизмов [14, 15].
Для усиления степени дезинфекции многие исследователи предлагают использовать явление ультразвуковой кавитации. Так, показано, что ультразвук с частотой 25 кГц, способен разрушать ряд бактерий и многоклеточных организмов, а также – некоторые соединения-метаболиты культивируемых гидробионтов [16-18, 14], что повышает качество циркулирующей воды в УЗВ.
Поэтому в данной работе была проведена оценка эффективности совместного воздействия УФ-стерилизаторов и ультразвуковых установок на состав представителей сапрофитной и условно-патогенной микрофлоры воды установок замкнутого водоснабжения.
Материалы и методы
Дизайн исследования и характеристики экспериментальной установки
Исследование микрофлоры воды проводилось в установках замкнутого водоснабжения объёмом 2000 л, с системами механической и биологической очистки и подменой 10% воды. Экспериментальная установка, состоящая из УФ-стерилизатора и ультразвукового оборудования, была размешена перед выпуском из биофильтра, далее мы будем называть ее УФУЗ.
Установка УФУЗ напорного типа выполнена предприятием-изготовителем ООО «Новотех-ЭКО» (РФ, г. Вологда), с возможностью крепления на независимой стойке со шкафом управления (рис. 1). В исследовании применялась модель УОВ-ПВ-5 в исполнении ECO-1A105H40US, предназначенная для эксплуатации при температуре окружающего воздуха от +4°С до +40°С и относительной влажности воздуха не более 85% при 25ºС. УФУЗ, используемая в эксперименте, имела следующую комплектацию: универсальная монтажная стойка, камера обеззараживания (фотохимический реактор), ультразвуковой излучатель (кавитатор), патрубок для слива воды с краном, защитный кожух с окном для контроля свечения лампы, сменная УФ-лампа, кварцевый чехол, блок управления. Экспериментальная установка имеет следующие характеристики: эффективная доза 25 мДж/см2; производительность 5 л/ч; мощность ультразвукового кавитатора УЗ 0,12 кВт; частота ультразвуковых колебаний 25 кГц; УФ лампа амальгамная безозонового исполнения мощностью 30Вт.
Объём пропускаемой воды на период эксперимента, составлял 4 тыс. л/ч. В экспериментальной УЗВ содержались особи радужной форели (Oncorhynchus mykiss) общей биомассой 41,5 кг, средняя масса рыб составляла 276,6±14,1 граммов. Во время эксперимента кормление рыбы осуществлялось продукционным гранулированным кормом 6 мм (Coppens, Нидерланды), в соответствии с рыбоводными нормативами (норма кормления 2,33%, суточная норма 950 г).
Эксперимент включал следующие режимы работы системы очистки: без воздействия УЗ и УФ; группа с использованием источника УФ излучения; группа, включающая совместное воздействие УЗ+УФ. Отбор проб на микробиологические исследования производился через 3 суток после изменения режима работы УФУЗ, что является достаточным для изменения в составе микрофлоры воды.
|
|
|
Рисунок 1. Общий вид установка обеззараживания воды УФУЗ модели УОВ-ПВ-5 |
Figure 1. General view of the UV ultrasonic water disinfection unit of the UOV-PV-5 model
Отбор проб и культивация бактериальных культур
Отбор проб производили из спускного коллектора водоочистительной установки при помощи механического дозатора Plastomed f 500 с рабочим объемом 500мкл, с использованием стерильных наконечников Vertex 4340N00 объемом 1250 мкл. В качестве емкости для отбора проб использовали стерильные микропробирки с интегрированной крышкой GenFollower МСТВ015 объемом 1.5 мл.
Для культивации микрофлоры и ее последующего выделения использовали среду BHIA HIMEDIA M211(Brain Heart Infusion Agar; Агар с сердечно-мозговой вытяжкой), которую предварительно разливали по 6 мл в стерильные чашки Петри Plastilab серии Triple vented диаметром 60 мм. Среды приготавливали при помощи средоварки AGASTER ECO-Mini, разлив сред проводили в стерильных условиях в ПЦР-боксе с принудительной вентиляцией (Biosan DNA/RNA UV cleaner box UVC/T-M-AR). Чашки Петри, после разлива сред, подвергали сушке в термостате (BINDER серии BF 115 E1) при температуре 40°С, мощности воздушного потока 75% на протяжении 45-55 минут (в зависимости от степени влажности).
Посев отобранного материала в чашки Петри производили в течение 15 минут после отбора. Посев осуществляли общепринятым методом без разбавления в объемах 5 и 10 мкл в трех повторностях для каждой пробы. Для нанесения пробы использовали механические дозаторы Biohit серии PROLINE Pipettor объемами 5 и 10 мкл, соответственно.
После проведения посева, чашки Петри помещали в термостат в условия постоянной температуры 22°С для инкубации (общим сроком в 5 суток, приблизительно 120 часов).
По прошествии первых суток проводили подсчет бактериальной активности и отбор характерных «суточных» бактериальных колоний для их дальнейшей видовой идентификации. Перенос колоний осуществляли на ранее заготовленные чашки Петри со средой BHIA HIMEDIA M211(Brain Heart Infusion Agar; Агар с сердечно-мозговой вытяжкой) разлитой по 6 мл. Данную операцию выполняли между каждой новой колонией для обеспечения чистоты материала. Каждые сутки вели подсчет динамики бактериальной активности. По окончании процесса инкубации подсчитывали общее число колоний.
В качестве средств родовой и видовой идентификации использовали визуальные отличительные признаки колоний. Данные получены в результате микроскопии на световом микроскопе (Olympus BX53) с окулярной приставкой (ToupCam 16.0 MP) и инвертированном микроскопе Биомед Мир-1 с объективами EA10, PL40, EA100; использования сред-индикаторов: Питательная среда N14 ГРМ, Питательная среда N7 ГРМ, Питательная среда N6 ГРМ, Питательная среда N13 ГРМ (ФГБУН ГНЦПМБ); идентификационные тесты: набор определения цитохромоксидазы по Эрлиху (ГБУН НИИ ЭМП), набор для окраски по Грамму МИКРО-ГРАММ-НИЦФ, системы индикаторные бумажные для идентификации микроорганизмов наборы N1, N2, а также тестовые реакции на каталазу, оксидазу, глюкозу. Все определенные морфологические и биохимические характеристики колоний бактерий сравнивали с Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition [19].
Статистическая обработка
Данные, по сравнению численности и представленности микроорганизмов, представлены как среднее ± SD; статистическая значимость определялась с помощью теста Манна – Уитни (значение p <0,05 принималось как статистически значимое). Для сравнения данные количества микроорганизмов, при разных режимах работы, представлены в виде Log10(КОЕ/мл). Статистические данные обрабатывались с помощью программы GraphPad Prism версии 8.0 (GraphPad. San Diego. CA. USA).
Результаты
Общая обсемененность воды в контроле составила 1,8×103 КОЕ/мл, что говорит о высоком качестве воды в исследуемой УЗВ. В результате исследования воды, без обработки ультрафиолетовым излучением и ультразвуком (контроль), была определена таксономическая принадлежность 18 бактериальных культур типа Proteobacteria (рис. 2, а). Среди них наибольшей представленностью обладали следующие виды Escherchia coli (21% от общего числа видов), Enterobacter cloacae (13,5%), Pseudomonas sp. (11.59%) и P. aeroginosa (4,56%). Среди ключевых родов микроорганизмов наибольшей относительной встречаемостью обладали представители Escherchia (21% от общего числа родов), Pseudomonas (19%), Enterobacter (18%) и Aeromonas (15%) (рис. 2, б). Неклассифицированные организмы составляли около 14% (2,52×102 КОЕ/мл) от общего количества культивированных бактерий. Такие рода как Proteus, Serratia и Acinetobacter обладали наименьшей встречаемостью – от 3 до 5%.
Применение ультрафиолета (УФ) привело к снижению общей численности бактерий до 1,2×102 КОЕ/мл, что подтверждает эффективность работы ультрафиолетовой установки.
Включение в систему очистки ультразвука способствовало изменению количества сапрофитной микрофлоры УЗВ. Общая обсемененность воды УЗВ в данной группе составила 1,1×102 КОЕ/мл. Так, оба режима работы приводили к достоверному снижению (p <0.05) относительной численности рода Escherchia, относительно контрольного режима работы (рис. 2, в), при этом увеличивалась встречаемость рода Pseudomonas (рис. 2, г). При использовании УЗ и УФ в воде наблюдалось полное исчезновение таких видов, как Pseudomonas pertucinogena и P. alcaligenes, а также – большинства представителей рода Aeromonas (за исключением A. hydrophila).
|
|
|
Рисунок 2. Относительная встречаемость видов сапрофитной и условно-патогенной микрофлоры холодноводных УЗВ: (а) – относительная встречаемость видов микрофлоры; (б) – относительная встречаемость родов микрофлоры; (в, г) – сравнение относительной встречаемости родов Escherchia и Pseudomonas при опытных и контрольном режиме работы УФУЗ Figure 2. Relative occurrence of saprophytic and conditionally pathogenic microflora of cold-water ultrasound: (a) – relative occurrence of microflora species; (b) – relative occurrence of microflora genera; (c, d) – comparison of the relative occurrence of Escherchia and Pseudomonas genera in experimental and control modes of UFUZ operation |
Воздействие УФ и УЗ существенно повлияло на количество всех видов обнаруженных микроорганизмов.
Бактериостатический эффект был наиболее выражен на представителях рода Proteus (P. vulgaris и Proteus sp.), где Log10(КОЕ/мл) достоверно снижался до 0,75±0,06 (p <0.05; рис. 3, а, б). Действие УФ и совместное применение с УЗ также повлияло на количество бактерий видов Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeroginosa и Escherchia coli, достоверно снижая КОЕ/мл относительно контрольного режима работы (p <0.05; рис. 3, в, д, е). УФ показал низкую эффективность по отношению к Enterobacter cloacae, вызывая недостоверное снижение количества микроорганизмов до 1,74±0,33 Log10 (рис. 3, г). При этом совместное действие УФ и УЗ привело к достоверному снижению КОЕ (p <0.05) до 0,94±0,05 Log10.
|
|
|
Рисунок 3. Количество колониеобразующих единиц видов микрофлоры УЗВ при разных режимах работы УФУЗ |
Figure 3. The number of colony-forming units of the types of ULTRASOUND microflora under different modes of operation of UFUZ
Обсуждение
Проведенные исследования показали перспективность совместного действия ультрафиолетового излучения и ультразвука частотой 25 кГц, при использовании в установках замкнутого водоснабжения, для снижения микробиологической обсемененности. Совместное применение позволяет снизить количество циркулирующей микрофлоры в водной среде УЗВ на 93,9%, относительно контрольного режима работы. Необходимо отметить, что самостоятельное применение УФ излучения снижает общее количество микрофлоры, однако добавление в систему очистки установки ультразвуковой кавитации приводит к гибели условно-патогенной флоры, которая может вызывать бактериальные болезни рыб. В данной работе снижение количества микроорганизмов наблюдалось уже на третьи сутки, что позволяет предположить возможность поддерживать количество микроорганизмов на стабильно низком уровне при постоянной работе УФУЗ.
Обнаруженные в воде сапрофитные микроорганизмы преимущественно относились к типу Протеобактерий, представители которого активно участвуют в очистке воды [5, 20, 21].
Достоверное снижение количества КОЕ отмечается для следующих видов микроорганизмов: Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeroginosa и Escherchia coli, Enterobacter cloacae и Proteus vulgaris, относительно контрольного режима работы. Подобные результаты были получены другими авторами [22, 23]. Следует отметить, что ранее нами было показано достоверное снижение некоторых представителей перифитона элементов фильтрации, при совместном воздействии ультразвуковой кавитации и УФ облучения [24-26]. Более того, S. Knobloch [27] доказал, что применение УЗ установки оказывает влияние не только на микрофлору воды, но и на микробиом кожи культивируемых гидробионтов. Поэтому мы предполагаем, что установка УФУЗ оказывает воздействия на все элементы экосистемы биофильтра и водной среды УЗВ.
Следовательно, мы можем рекомендовать совместное использование ультразвуковой кавитации и ультрафиолетового излучения для поддержания качества циркулируемой воды в установках замкнутого водоснабжения.
Выводы
В условиях холодноводных УЗВ, с невысокой биологической нагрузкой, микробиологическая обсемененность, даже без применения УФ, сохраняется на достаточно низком уровне (1,8×103 КОЕ/мл).
Включение в состав фильтрующей системы УФ-стерилизатора и источника ультразвуковой кавитации позволяет снизить обсеменённость водной среды до крайне низких значений 1.2×102 КОЕ/мл и 1.1×102 КОЕ/мл, соответственно.
Применение УФУЗ установки привело к достоверному снижению (при p<0.05) относительной встречаемости рода Escherchia и увеличению встречаемости представителей рода Pseudomonas.
УФ показал низкую эффективность по отношению к Enterobacter cloacae, тогда как совместное действие УФ и УЗ привело к достоверному снижению колониеобразующих единиц до 0.94±0.05 Log10 (при p <0.05).
Статья подготовлена по результатам исследования, выполненного при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Соглашения о предоставлении из федерального бюджета субсидии на развитие кооперации российской образовательной организации высшего образования и организации реального сектора экономики в целях реализации комплексного проекта по созданию высокотехнологичного производства № 075-11-2022-004 от 6 апреля 2022 г.)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад в работу авторов: Д.Л. Никифоров-Никишин – идея работы, подготовка введения, заключения, окончательная проверка статьи; А.В. Горбунов – статистический анализ данных, оформление графического материала; О.Г. Бугаев – подготовка результатов и материалов и методов, подготовка статьи; С.В. Смородинская – подготовка и анализ литературных источников; Н.И. Кочетков – подготовка статьи к публикации, написание обсуждения.
1. Lekang, O.-I., 2013. Aquaculture Engineering - Second Edition. John Wiley and sons.
2. Bregnballe, J. (2015). Guidelines for recycling aquaculture. FAO and the international organization EUROFISH.
3. Komlatsky, V.I., Komlatsky, G.V., Alexandrovich, V.V. (2018). Fish farming. Scientific journal "Concept".
4. Hyupeden, J., Wemheuer, B., Indenbirken, D., Schultz, K., & Shpik, E. (2020). Taxonomic and functional profiling of nitrifying biofilms in freshwater, brackish and marine RAS biofilters. Aquaculture Engineering, 90, 102094.
5. Suurnakki S., Pulkkinen J. T., Lindholm-Lehto P.S., Tiirola M. and Aalto S. L. (2020). Effect of peracetic acid on microbial community, water quality, nitrification and productivity of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in aquaculture recycling systems. Aquaculture, 516, 734534.
6. Pedersen, L.F., Pedersen P.B., Nielsen J. L. and Nielsen P.H. (2009). Decomposition of peracetic acid and the effect on nitrification in aquaculture recycling systems. Aquaculture, 296(3-4), 246-254.
7. Michaud L., Blancheton J.P., Bruni V. and Piedrahita R. (2006). The effect of dispersed organic carbon on heterotrophic bacterial populations and the effectiveness of nitrification in biological filters. Aquaculture Engineering, 34 (3), 224-233.
8. Rud I., Kolarevich J., Holan A. B., Berge I., Calabrese S. and Terjesen B. F. (2017). Deep sequencing of bacterial microbiota in industrial recirculation and semi-closed aquaculture systems for Atlantic salmon production after tarring. Aquaculture Engineering, 78, 50-62.
9. Aalto S.L., Syropoulou E., de Jesus Gregersen K.J., Tiirola M., Pedersen P.B. and Pedersen L.F. (2022). Microbiome reaction to foam fractionation and ozonation in RAS. Aquaculture, 550, 737846.
10. Legarda, E.K., Poly, M.A., Martins, M.A., Pereira, S.A., Martins, M.L., Machado, K., ... and do Nascimento Vieira, F. (2019). Integrated aquaculture recycling system for mullet and shrimp using biofloc technology. Aquaculture, 512, 734308.
11. Tabarrok M., Seifabadi J., Salehi Juzani G. and Younesi H. (2020). Comparison between recirculating aquaculture and biofloc systems for growing juvenile common carp (Cyprinus carpio): growth indicators, hematoimmunological indicators, water quality and microbial communities. Aquaculture Research, 51(12), 4881-4892.
12. Fossmark R.O., Vadstein O., Rosten T.V., Bakke I., Kosheto D., Bugten A.V., ... and Attramadal K. J. (2020). The effect of reducing organic matter loading by membrane filtration on the dynamics of the microbial community in aquaculture recycling systems (RAS) with Atlantic salmon parr (Salmo salar). Aquaculture, 524, 735268.
13. Madge, B.A., and Jensen, J.N. (2006). Ultraviolet disinfection of E. coli in urban wastewater: the effect of particle size. Water Environment Research, 78(3), 294-304.
14. Gogate P.R. and Kabadi A.M. (2009). Overview of cavitation applications in biochemical engineering/biotechnology. Journal of Biochemical Engineering, 44 (1), 60-72.
15. Narkis, N., Armon, R., Offer, R., Orshansky, F., & Friedland, E. (1995). The effect of suspended solids on the effectiveness of disinfection of wastewater with chlorine dioxide. Water research, 29 (1), 227-236.
16. Tan, U.K., Chia, S.K., Parthasarathi, S., Rajesh, R.P., Pang, K.H. and Manikam, S. (2021). Fish pond water purification using ultrasonic cavitation and advanced oxidation processes. Chemosphere, 274, 129702.
17. Dosti, M.R., Kargar, R. and Sayadi, M.H. (2012). Water purification using ultrasound: an overview. Proceedings of the International Academy of Ecology and Environmental Sciences, 2 (2), 96.
18. Nam-Kun H., Schroeder J.P., Petrik G. and Schultz S. (2020). Preliminary testing of the effectiveness of ultrasonic disinfection in relation to individual pathogens of aquaculture. Aquaculture, 515, 734592.
19. Garrity G. Bergi ® Manual on Systematic Bacteriology: Volume 2: Proteobacteria, Part B: Gammaproteobacteria. - Springer Science & Business Media, 2007. - Vol. 2.
20. Qin, Y., Hou, J., Deng, M., Liu, K., Wu, S., Ji, Y., and He, H. (2016). Abundance and diversity of bacteria in pond water supplied with various feeds. Scientific reports, 6(1), 1-13.
21. Paniagua-Michel, J. (2017). Wastewater treatment using phototrophic-heterotrophic biofilms and microbial mats. Prospects and Challenges in algae biotechnology, 257-275.
22. Karama, E.F., & Sunarko, I. (2013). Disinfection of Escherichia coli bacteria using hydrodynamic cavitation. International Journal of Technology, 4(3), 209-216.
23. Annisha, O.D.R., Li, Z., Zhou, H., Steney Jr., N. M.D., and Dongde, O.O. (2019). The effectiveness of integrated ultraviolet ultrasound technologies in the removal of E. coli resistant to erythromycin and quinolones from domestic wastewater using a laboratory experiment. Journal of Water Supply, Sanitation and Hygiene for Development, 9(3), 571-580.
24. Klimov V.A. et al. Change in the composition of the periphyton of filtration elements of closed water supply installations under the combined effect of UV radiation and ultrasound //Bulletin of the Astrakhan State Technical University. Series: Fisheries. - 2022. - №. 4. - Pp. 113-122. - DOIhttps://doi.org/10.24143/2073-5529-2022-4-113-122
25. Nikiforov-Nikishin D.L. et al. Temperature differentiation of the aquatic microflora of a closed water supply system on the example of incubation of microbiological cultures at 21 and 37 °C // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. - IOP Publishing, 2021. - -. 723. - №. 4. - 042049.
26. Smorodinskaya S.V., Bugaev O.G., Gorbunov A.V. and Zhavnerov A.N. (2021, March). Potentially dangerous to humans pathogenic thermophilic microorganisms of fish in recirculating aquaculture systems. In the IOP Conference series: Earth and Environmental Science (Volume 723, No. 4, p. 042074). IOP Publishing.
27. Knobloch S., Philip J., Ferrari S., Benheim D., Bertrand M. and Poirier I. (2021). The effect of ultrasonic antifouling protection on the growth and microbiota of farmed European sea bass (Dicentrarchus labrax). Bulletin on Marine Pollution, 164, 112072.
