Россия
Россия
Россия
УДК 63 Сельское хозяйство. Лесное хозяйство. Охота. Рыбное хозяйство
ГРНТИ 34.01 Общие вопросы биологии
ОКСО 06.06.01 Биологические науки
ББК 28 Биологические науки
ББК 472 Рыбное хозяйство
ТБК 564 Водное хозяйство
Работа посвящена определению сроков выведения трифенилметановых красителей (например, малахитового зеленого и фиолетового «К») из организма рыб после лечебно-профилактических обработок. На территории Российской Федерации их использование в аквакультуре было прекращено. Альтернативной замены этим препаратам не найдено, что привело к ухудшению эпизоотической ситуации на рыбоводных хозяйствах. Установленные сроки выведения малахитового зеленого для радужной форели составляют 282 суток (10 месяцев), фиолетового «К» в период летнего выращивания карпа – 40 суток (1,5 месяца). Использование красителей во время инкубации и на первом году выращивания рыб, при соблюдении этих сроков, позволит получить рыбную продукцию без остаточного количества трифенилметановых красителей
аквакультура; заболевания рыб; иммуноферментный анализ; малахитовый зеленый; органические красители; профилактика; терапия; фиолетовый «К»
Введение
Ухудшение условий обитания привело к снижению численности рыб в естественных водоемах, что повлияло на сокращение рыбных запасов и необходимость резко увеличить объем продукции аквакультуры. Однако одним из сдерживающих факторов развития этого направления являются болезни культивируемых гидробионтов. Первостепенное место в борьбе с заболеваниями отводится профилактическим мероприятиям, направленным на предупреждение их возникновения, в число которых входит противопаразитарная обработка икры и молоди.
Профилактическая обработка во время инкубации икры позволяет избежать возникновения грибкового заболевания – сапролегниоза, который может привести к 100% гибели эмбрионов. Она также направлена на предотвращение эктопаразитарных инвазий (костиоза, ихтиофтириоза, триходиниоза, хилоденеллеза) у молоди, которые наносят существенный экономический ущерб рыбоводным предприятиям. В мировом рыбоводстве для борьбы с этими заболеваниями одним из первых препаратов стал использоваться органический краситель трифенилметанового ряда – малахитовый зеленый. В 1933 г. его опробовали на форели против сапролегнии, когда остальные препараты были неэффективны. В дальнейшем был проведен ряд исследований по его фунгицидному и антисептическому действию, что расширило его применение в аквакультуре [21]. Сведения о физических и химических свойствах малахитового зеленого, характере его действия, токсичности, накоплении в организме и устойчивости во внешней среде были обобщены в обзоре Альдермана [16]. Однако позднее, по мере использования, были установлены его побочные действия на организм рыбы и теплокровных животных [18; 19; 22; 23; 25; 30].
Гидробионты интенсивно поглощают препарат из воды, и он накапливается в большей степени в виде основания – лейкомалахитового зеленого [20], который, обладая липофильной природой, продолжительное время сохраняется в жировой ткани, в связи с чем скорость его элиминации зависит от количества жира в организме [18; 32; 34]. Некоторые исследователи отмечают, что основание малахитового зеленого обладает канцерогенными свойствами [22; 31], но его токсичность в несколько раз меньше, чем самого красителя [17; 24; 26; 33].
В России, кроме малахитового зеленого, широкое применение получили фиолетовый «К» и бриллиантовый зеленый (основной ярко-зеленый) как лечебно-профилактические средства против эктопаразитозов рыб. Их успешно использовали для разных видов и возрастных групп рыб.
Однако в 2011 г. был принят технический регламент на пищевую продукцию, в соответствии с которым остаточное количество трифенилметановых красителей в товарной рыбе не допускается [12].
Список лекарственных препаратов в области ветеринарии в настоящее время на территории Российской Федерации ограничен, в особенности для выращивания товарной рыбной продукции [6; 11; 13]. Прошедших регистрацию лекарственных средств недостаточно для результативного контроля эпизоотических ситуаций на рыбоводных предприятиях.
Альтернативной замены трифенилметановым красителям пока не найдено, но существуют препараты со схожим действием на возбудителей, которые не имеют лицензии на территории РФ или недостаточно эффективны по сравнению с красителями. Например, Pyceze vet. для обработки рыб и икры против сапролегнии в странах ЕС, в основе которого 2-бром-2-нитро-пропан-1,3-диол (торговое название – бронопол) [29]. В российский ветеринарный реестр лекарственных средств включен «Девастин» (МНН – повидон йод) для борьбы с простейшими (хилодонеллами и триходинами) и моногенеями (гиродактилюсами и дактилогирусами) у карповых рыб, но не установлено его влияние на сапролегнию и ихтиофтириус, которые вызывают заболевания и гибель рыбы в рыбоводных хозяйствах.
В экстренных случаях, когда неэффективны зарегистрированные препараты, для предупреждения развития сапролегниоза икры и вспышек протозойных заболеваний у молоди рыб, использование проверенных на практике трифенилметановых красителей позволило бы снизить ущерб предприятиям аквакультуры, наносимый болезнями.
Целью работы являлось определить остаточное количество в рыбе малахитового зеленого и фиолетового «К» и установление сроков их выведения из организма после лечебно-профилактических обработок.
Материалы и методы исследования
Работа проведена в экспериментальных и производственных условиях на трех видах основных объектов товарной аквакультуры – бестере, радужной форели и карпе. Обработку рыбы трифенилметановыми красителями (малахитовым зеленым и фиолетовым «К») проводили согласно нормативным документам и наставлениям по применению органических красителей для лечебно-профилактических обработок рыбы и инкубируемой икры на рыбоводных хозяйствах [1; 2; 3; 7; 8; 9; 10; 14].
Определение в рыбе остаточного количества трифенилметановых красителей (суммарное содержание красителей и их лейко-оснований) осуществляли в соответствии с нормативной документацией [5].
В целях скрининга использовали непрямой твердофазный конкурентный иммуноферментный анализ (ИФА), который проводили с помощью тест-систем (Malachite Green/Leucomalachite Green plate kit, Abraxis и Malachite Green/Leucomalachite Green EIA, EuroProxima). Предел обнаружения составлял 0,125-25 мкг/кг. При предполагаемом высоком количестве красителя (материал отбирали сразу после обработок), пробы разводили 10 или 100 раз. Отрицательными считали результаты, показавшие значение содержания трифенилметановых красителей ниже предела количественного определения – 2 мкг/кг, который указан с учетом номинального содержания малахитового зеленого в тест-системе.
Эксперименты осуществляли следующим образом:
1. Экспериментальная работа с малахитовым зеленым на бестере и радужной форели.
Бестер. Для опыта молодь средней массой 12 г была рассажена в 5-ти аквариумах (объемом по 30 л) с аэрацией. В одном аквариуме рыбу адаптировали и содержали в теплой воде (18℃), в трех – в холодной воде (7℃), и один аквариум с холодной водой, с не обработанной красителем рыбой, был контрольным. После адаптации провели однократную обработку малахитовым зеленым рыбы на теплой воде в течение 4 часов, на холодной – в течение 3 суток (табл.1).
Таблица 1. Схема обработки малахитовым зеленым молоди бестера
|
№ варианта |
Температура воды в аквариуме, ℃ |
Концентрация малахитового зеленого, г/м3 |
Экспозиция |
|
1 |
18 |
0,2 |
4 часа |
|
2 |
7 |
0,5 |
3 суток |
|
3 |
7 |
0,2 |
3 суток |
|
4 |
7 |
0,02 |
3 суток |
|
5 |
7 |
контроль |
- |
Отбор проб для определения остаточного количества малахитового зеленого и лейкомалахитового зеленого осуществляли после завершения обработки рыбы на теплой воде через час (вариант 1), на холодной – на следующие сутки. Для анализа брали целые тушки, а также отдельно – мышцы и внутренние органы. Оценивали суммарное количество малахитового зеленого и лейкомалахитового зеленого, кроме того в варианте 1 в тушке бестера дополнительно определили количество красителя без его лейко-основания.
Радужная форель. Опытную группу икры, для профилактики поражения сапролегнией в период инкубации, обработали малахитовым зеленым 8 раз (концентрация 10 г/м3 в течение 10-30 мин) при температуре воды 5-9℃. Контрольная группа оставалась необработанной. После вылупления личинки форели были рассажены в рыбоводные лотки с нормативной плотностью посадки для дальнейшего выращивания.
На 2-ом месяце выращивания (76-й день), в результате спонтанного возникновения в контрольной и опытной группах ихтиофтириоза, вся молодь форели была обработана малахитовым зеленым, согласно инструкции по его применению (трехкратно через день с концентрацией 0,5 г/м3 и экспозицией – 3 ч). Через сутки после каждой обработки оценивали зараженность форели ихтиофтириусами.
Общая продолжительность опыта составила 1 год, в течение которого производили отбор проб для определения суммарного остаточного количества малахитового зеленого и лейкомалахитового зеленого (табл.2).
Таблица 2. Сроки отбора проб для определения остаточного количества малахитового зеленого и лейкомалахитового зеленого в опыте на радужной форели
|
№п/п |
Обработка малахитовым зеленым |
Срок отбора проб после обработки, сутки |
|
1 |
инкубируемой икры |
76* |
|
2 |
молоди в возрасте 2-х месяцев |
6** |
|
21 |
||
|
33 |
||
|
42 |
||
|
44 |
||
|
92 |
||
|
204 |
||
|
282 |
||
|
356 |
||
|
380 |
||
|
Примечание: * – отбор проб молоди рыб после обработки инкубируемой икры перед обработкой от ихтиофтириоза; ** – отбор проб молоди рыб после обработки от ихтиофтириоза. |
||
2. Экспериментальная работа с фиолетовым «К» на карпе.
В экспериментально-производственных условиях в двух рыбоводных хозяйствах (вариант 1 и 2) две возрастные группы карпа (сеголетки и двухлетки) обрабатывали фиолетовым «К», согласно нижеприведенной схеме (табл.3).
Таблица 3. Схема обработки фиолетовым «К» карпа в осенне-весенний период в рыбоводных хозяйствах
|
Эксперимент |
Возраст рыбы |
Схема обработки |
|
|
Вариант 1 |
Сеголетки-годовики |
1) Осенью в вырастных прудах (0,2 г/м3); 2) Весной в зимовальных прудах перед обловом рыбы (0,2 г/м3); 3) В транспортной таре перед пересадкой в нагульные пруды (1,1 г/м3 30-40 мин) |
|
|
Двухлетки-двухгодовики |
|||
|
Вариант 2 |
Сеголетки-годовики |
1) Осенью в транспортной таре при пересадке на зимовку (5,6 г/м3 20 мин); 2) В бассейнах зимовального комплекса (1 г/м3 2 часа); 3) Весной в транспортной таре перед пересадкой в нагульные пруды (5,6 г/м3 20 мин) |
|
В 1-ом варианте у обеих возрастных групп пробы отбирали в летний период через 40 дней после последней обработки, во 2-ом варианте – в период летнего выращивания (70 дней после последней обработки) и дополнительно – осенью (145 суток после обработки).
Результаты исследований
Малахитовый зелёный
Бестер. На следующие сутки, после завершения обработки рыбы малахитовым зеленым в концентрации 0,2 и 0,5 г/м3, было выявлено его высокое накопление в организме – более 2500 мкг/кг (табл.4). При обработке рыбы в более низкой концентрации (0,02 г/м3) его содержание в организме оказалось меньше в 4 раза, но данная обработка не является рекомендованной при лечебно-профилактических мероприятиях.
Таблица 4. Остаточное суммарное количество малахитового зеленого и лейкомалахитового зеленого в организме бестера после обработки в холодной воде (7℃)
|
Концентрация красителя при обработке |
0,5 г/м3 |
0,2 г/м3 |
0,02 г/м3 |
|
Количество красителя в рыбе, мкг/кг |
~2500,00 |
~2500,00 |
594,85 |
При обработке рыбы в концентрации 0,2 г/м3 при температуре 7℃ (3 суток) и 18℃ (4 часа) было выявлено, что краситель накапливался в организме рыб на одном уровне – в пределах 2500 мкг/кг (табл. 4 и 5). При этом большую его часть – более 2400 мкг/кг (~96%) составлял лейкомалахитовый зеленый.
Сравнительный анализ содержания малахитового зеленого и его основания в мышцах и внутренних органах рыб показал, что эти вещества равномерно распределялись в организме (табл.5).
Таблица 5. Остаточное количество малахитового зеленого (МЗ) и лейкомалахитового зеленого (ЛМЗ) после обработки красителем при концентрации 0,2 г/м3 в теплой воде (18℃)
|
Проба |
Рыба |
Мышцы МЗ+ЛМЗ |
Органы МЗ+ЛМЗ |
|
|
МЗ |
МЗ+ЛМЗ |
|||
|
Количество красителя в рыбе, мкг/кг |
104,96 |
~2500,00 |
~2500,00 |
~2500,00 |
Радужная форель. У молоди в возрасте 2-х месяцев через 76 суток после обработки малахитовым зеленым, проведенной на стадии икры, суммарное остаточное количество красителя и лейкомалахитового зеленого составило 25 мкг/кг.
При содержании рыб, для дальнейшего отслеживания снижения красителя, в их организме произошло спонтанное заражение паразитическими простейшими (Ichthyophthirius multfiliis), в связи с чем была проведена 3-х-кратная лечебная обработка рыбы малахитовым зеленым. После обработок у молоди форели при паразитологическом анализе простейших не обнаружили, что ещё раз продемонстрировало высокую эффективность этого препарата при эктопаразитозах. Динамика снижения зараженности рыбы ихтиофтириусами представлена на рисунке 1.
Рисунок 1. Динамика зараженности молоди форели ихтиофтириусами после обработки малахитовым зеленым
Остаточное количество малахитового зеленого и лейкомалахитового зеленого определяли в рыбе в течение 380 дней с периодичностью согласно приведенной ранее схеме отбора проб.
Результаты анализа показали, что снижение содержания красителя в организме радужной форели происходит медленно: в течение первых трех месяцев его количество составляло 2500 мкг/кг, через шесть месяцев снижалось до 250 мкг/кг, через семь месяцев – до 10 мкг/кг и только через десять месяцев – до 1,975 мкг/кг, что является ниже предела количественного определения и считается отрицательным результатом (рис.2).
Рисунок 2. Динамика снижения суммарного остаточного количества малахитового зеленого и лейкомалахитового зеленого у радужной форели
В течение эксперимента при отборе проб у радужной форели проводили клинический осмотр, патологоанатомическое вскрытие и обследование внутренних органов. В целом отклонений от нормы не выявляли, но у 20% рыб в конце эксперимента отметили гипертрофию печени, но при этом, по результатам гистологического анализа печени, изменений гепатоцитов не выявлено[1]
Фиолетовый «К»
Остаточное количество фиолетового «К» определяли у карпа в период летнего выращивания в рыбоводных хозяйствах (вариант 1 и 2). В варианте 1 у двухлеток и трехлеток остаточное количество красителя на 40 сутки находилось на уровне ниже предела количественного определения (2 мкг/кг), что является отрицательным результатом (табл. 6). В другом рыбоводном хозяйстве (вариант 2) у двухлеток карпа через 70 суток и 145 суток после обработки анализ показал аналогичные результаты. Таким образом, можно принять 40 дней, как срок выведения фиолетового «К» из организма карпа в период летнего выращивания.
Таблица 6. Данные по остаточному количеству красителя у карпа (из нагульных прудов) после обработки фиолетовым «К» в осенне-весенний период
|
Эксперимент |
Возраст рыбы при отборе проб на анализ |
Срок отбора проб после обработки, сут |
Результат, мкг/кг |
|
Вариант 1 |
Двухлетки |
40 |
~0,825 |
|
Трехлетки |
~1,025 |
||
|
Вариант 2 |
Двухлетки |
70 |
~0,975 |
|
145 |
~0,950 |
Обсуждение результатов
Впервые в отечественных научных исследованиях получены данные по срокам выведения трифенилметановых красителей из рыбы.
Результаты иммуноферментного анализа показали, что непосредственно после обработок малахитовым зеленым в рекомендованных для аквакультуры дозировках первоначально количество его в организме превышает 2500 мкг/кг.
Остаточное количество малахитового зеленого после обработки молоди форели в возрасте 2-х месяцев снижается медленно и достигает отрицательного результата через 282 дня (10 месяцев).
Срок выведения фиолетового «К» после профилактических обработок карпа в осенне-весенний период в прудовых хозяйствах при летнем выращивании составляет 40 сутки (1,5 месяца).
Полученные результаты по срокам выведения малахитового зеленого из организма рыб сопоставимы с данными из зарубежных источников, в которых указано, что краситель выводится от нескольких месяцев до 1 года [27; 28]. Подобная информация по фиолетовому «К» отсутствует.
Для подтверждения полного выведения красителей из организма рыб образцы были переданы в лабораторию испытательного центра ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» («ВГНКИ») на анализ остаточного количества красителей методом сверхэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (СВЭЖХ-МС/МС). Анализы были выполнены в соответствии с методической документацией количественного определения трифенилметановых красителей в продукции аквакультуры [4; 15]. Результаты, полученные при проведении арбитражного метода, оказались сопоставимы с нашими данными.
Кроме этого в ходе проведения исследования получены некоторые дополнительные данные. Температура воды при обработке (опыт на бестере) не оказала значимого влияния на остаточное количество малахитового зеленого в рыбе.
Различие в содержании препарата в мышцах и комплексе внутренних органов не было выявлено.
После обработки малахитовым зеленым (согласно нормативным документам по его применению) рыб большую его часть (96%) составляет его основание – лейкомалахитовый зеленый.
Выводы
Таким образом, соблюдение установленных сроков выведения малахитового зеленого и фиолетового «К» из организма рыбы позволяет получить рыбную продукцию без остаточного количества трифенилметановых красителей.
Высокая эффективность трифенилметановых красителей для борьбы с сапролегниозом и многими эктопаразитозами объектов аквакультуры, с учетом установленных сроков их выведения из организма рыбы, позволяют рекомендовать их с лечебно-профилактической целью: для обработки икры в период инкубации и молоди на первом году выращивания (малахитовым зеленым – в первые 3 месяца, фиолетовым «К» – в течение первого года).
[1] Авторы выражают признательность за проведенный гистологический анализ доктору биологических наук В.А.Илясовой В.А.
1. Ветеринарно-санитарные правила для лососевых рыбоводных заводов - утв. Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 21 мая 1985 г.
2. Временное наставление по применению основного фиолетового «К» для борьбы с сапролегниозом икры осетровых рыб - утв. Главным управлением ветеринарии Государственного агропромышленного комитета СССР 3 февраля 1987 г.
3. Головин П.П., Головина Н.А., Романова Н.Н. Кадастр лечебных препаратов, используемых и апробированных в аквакультуре России и за рубежом. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2005. - 56 с.
4. ГОСТ Р 56962-2016 «Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Метод определения остаточного содержания трифенилметановых красителей с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии с времяпролетным масс-спектрометрическим детектором высокого разрешения». - М.: Стандартинформ, 2016. - 12 с.
5. ГОСТ 57025-2016 «Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Иммуноферментный метод определения остаточного содержания трифенилметановых красителей». - М.: Стандартинформ, 2016. - 19 с.
6. Государственный реестр лекарственных средств для ветеринарного применения [Электронный ресурс]. - URL: https://irena.vetrf.ru/irena/operatorui?_action=clearRegListMedicine (дата обращения 29.08.2019).
7. Наставление по применению малахитового зеленого при ихтиофтириозе карпов - утв. утв. Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 14 марта 1969 г.
8. Наставление по применению основного ярко-зеленого (бриллиантового зеленого) для лечебно-профилактической обработки рыбы в тепловодных бассейновых рыбных хозяйствах - утв. Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 18 октября 1983 г.
9. Наставление по борьбе с сапролегниозом икры карпа при заводском способе получения потомства - утв. Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 5 марта 1979 г.
10. Наставление по применению технических и органических красителей (основного ярко-зеленого и фиолетового «К») для профилактической обработки рыб в зимовальных прудах - утв. Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 19 апреля 1971 г.
11. Технический регламент Евразийского экономического союза "О безопасности рыбы и рыбной продукции" № ТР ЕАЭС 040/2016. Принят Решением Совета Евразийской экономической комиссии № 162 от 18 октября 2016 года.
12. Технический регламент Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции" № ТР ТС 021/2011. Утвержден Решением Комиссии Таможенного союза № 880 от 9 декабря 2011 года.
13. Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 13.02.2018 N 28 "О максимально допустимых уровнях остатков ветеринарных лекарственных средств (фармакологически активных веществ), которые могут содержаться в непереработанной пищевой продукции животного происхождения, в том числе в сырье, и методиках их определения".
14. Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб / М.: Отдел маркетинга АМБ-агро, 1998. - Ч. 1. - 310 с.
15. Сорокин А.В., Нестеренко И.С., Комаров А.А. Методика количественного определения трифенилметановых красителей в продукции аквакультуры// Ветеринария, 2019. - №3. - С. 57-64.
16. Alderman D.J. Malachite green: a review// Journal of Fish Diseases, 1985. - № 8. - P. 289-298.
17. Analysis of mutations and bone marrow micronuclei in Big Blue rats fed leucomalachite green/ M.G. Manjanatha, S.D. Shelton, M. Bishop, J.G. Shaddock, V.N. Dobrovolsky, R.H. Heflich, P.J. Webb, L.R. Blankenship, F.A. Beland, K.J. Greenlees, S.J. Culp // Mutation Research, 2004. - № 547. - P. 5-18.
18. Carcinogenicity of malachite green chloride and leucomalachite green in B6C3F1 mice and F344 rats / S.J. Culp, P.W. Mellick, R.W. Trotter, K.J. Greenlees, R.L. Kodell, F.A. Beland // Food and Chemical Toxicology, 2006. - № 44. - P. 1204-1212.
19. Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress of malachite green on the kidney and gill cell lines of freshwater air breathing fish Channa striata/S.A. Majeed, K.S. Nambi, G. Taju, S. Vimal, C. Venkatesan, A.S. Hameed // Environ. Sci. Pollut. Res., 2014. - № 21. - P. 13539-13550.
20. Development and validation of a fast monoclonal based disequilibrium enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of triphenylmethane dyes and their metabolites in fish / M. Oplatowska, L. Connolly, P. Stevenson, S. Stead, C. T. Elliott //Analytica Chimica Acta, 2011. - № 698. - P. 51-60.
21. Foster F.J., Woodbury L. The Use of Malachite Green as a Fish Fungicide and Antiseptic// The Progressive Fish-Culturist,1936. - №18. - P. 7-9.
22. Genotoxicity of malachite green and leucomalachite green in female Big Blue B6C3F1 mice/R.A. Mittelstaedt, N. Mei, P.J. Webb, J.G. Shaddock, J.G. Dobrovolsky, L.J. McGarrity, S.M. Morris, T. Chen, F.A. Beland, K.J. Greenlees, R.H. Heflich // Mutation Research, 2004. - № 561. - P. 127-138.
23. Host-tailored sensors for leucomalachite green potentiometric measurements/ F. T. C. Moreira, R. B. Queirós, L. A. A. Truta, T. I. Silva, R. M. Castro, L. R. Amorim, M. G. Sales // Journal of Chemistry, 2013. - 13 pp.
24. In vitro interactions of malachite green and leucomalachite green with hepatic drug-metabolizing enzyme systems in the rainbow trout (Onchorhyncus mykiss)/ С. Nebbia, F. Girolami, M. Carletti, L. Gasco, I. Zoccarato, A. Giuliano Albo // Toxicology Letters, 2017.
25. Mever F.P., Jorgenson T.A. Teratological and Other Effects of Malachite Green on Development of Rainbow Trout and Rabbits// Transactions of the American fisheries society, 1989. - V. 112. - P.818-824.
26. Minta M., Wilk-Zasadna I. Effects of malachite green and its major metabolite, leucomalachite green, in micromass cultures of rat embryonic cells// Bull. Vet. Isnt. Pulawy., 2007. - №51. - P. 695-700.
27. Mitrowska K., Posyniak A. Determination of malachite green and its metabolite, leucomalachite green, in fish muscle by liquid chromatography // Bull Vet Inst Pulawy, 2004. - №48. - P. 173-176.
28. Persistence of malachite green in tissues of rainbow trout after a long-term therapeutic bath / J. Machova, Z. Svobodova, J. Svobodnik, V. Piacka, B. Vykusova, A. Kocova //Acta Veterinaria Brno, 1996. - № 65. - P. 151--59.
29. Pottinger T.G., Day J.G. A Saprolegnia parasitica challenge system for rainbow trout: Assessment of Pyceze as an anti-fungal agent for both fish and ova// Diseases of Aquatic Organisms, 1999. -№36 (2). - P. 129-141.
30. Radko l., Minta M., Stypula-Trebas S. Cellular toxicity of malachite green and leucomalachite green evaluated on two rat cell lines by MTT, NRU, LDH and protein assays// Bull Vet Inst Pulawy, 2011. - № 55. - P. 347-353.
31. Synthesis and characterization of N-demethylated metabolites of malachite green and leucomalachite green/ B.P. Cho, T. Yang, L. R. Blankenship, J. D. Moody, M. Churchwell, F. A. Beland, S. J. Culp // Chem. Res. Toxicol., 2003. - № 16. - P. 285-294.
32. The persistence of malachite green in the edible tissue of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) / L. Alborali, E. Sangiorgi, M. Leali, P.F. Guadagnini, S. Sicura // Rivasta Italiana di Acquacoltura, 1997. - № 32 (2). - P. 45-60.
33. Toxicity evaluation with Vibrio fischeri test of organic chemicals used in aquaculture/ M.D. Hernando, S. De Vettori, M.J. Martıґnez Bueno, A.R. Fernaґndez-Alba // Chemosphere, 2007. - № 68. - P. 724-730.
34. Uptake and elimination of malachite green in rainbow trout (in German) / K. Bauer, H. Dangschat, H.O. Knoppler, J. Neudegger // Archiv fur Lebensmittel-hygiene, 1988. - № 39. - P. 97-102.
