Введение

Криотехнологии, получившие широкое распространение во всем мире, стали незаменимым инструментом для сохранения и восстановления генетического разнообразия видов.

В самом крупном в России низкотемпературном генетическом банке Филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «ВНИРО» («ВНИИПРХ») разработаны и успешно применяются высокоэффективные технологии криоконсервации спермы осетровых и карповых рыб, которые, в случае использования половых продуктов высокого качества, обеспечивают сохранение оплодотворяющей способности замороженной спермы на уровне нативной [1]. Образцы криоконсервированной спермы из коллекции криобанка часто используются в рыбохозяйственной практике для получения потомства в отсутствие зрелых самцов, восстановления редких и исчезающих видов, получения промышленных гибридов, в других селекционных исследованиях.

Тем не менее, потребность в оптимизации технологий криоконсервации спермы рыб остается актуальной, в связи с непостоянством качества используемой нативной спермы, обусловленным влиянием окружающей среды и условий содержания производителей на процесс сперматогенеза.

Данная работа является продолжением ранее проведенного исследования, публикация результатов которого содержала также краткую историю разработки и детальный обзор способов криоконсервации спермы карповых рыб, применяемых в мировой практике в последние два десятилетия [2].

Представляемые протоколы криоконсервации спермы карповых рыб, оптимизированные на основании результатов экспериментов, проведенных на материале разного качества, обеспечивают с высокой эффективностью как замораживание больших объемов спермы в лабораторных и полевых условиях, так и быстрый сбор образцов в условиях экспедиции.

Материалы и методы

Сперму и икру карповых рыб, выращенных в опытном селекционно-племенном хозяйстве «Якоть» «ВНИИПРХ», получали в соответствии с действующими нормативами [3]. Объектами исследования были: сперма и икра сазана амурского, сазана волжского, карпа линейного, карпа московского чешуйчатого, карпа московского разбросанного, карпа загорского чешуйчатого.

Транспортировка половых продуктов осуществлялась при температуре 1-5^оС в термосумке с хладоэлементами. Качество нативной спермы, после ее активации технологической водой, оценивалось по подвижности, определяемой под микроскопом (Микромед-3 LED M, Микромед, Россия) при увеличении в 300-400 раз по процентному отношению клеток с прямолинейно поступательным движением к общему количеству клеток в поле зрения. В экспериментах использовались образцы спермы с подвижностью от 50 до 100%.

Перед криоконсервацией, охлажденная до 10-12^оС, сперма разбавлялась охлажденной до той же температуры экспериментальной криозащитной средой в объемном отношении 1:1 или 1:2. Среда добавлялась к сперме по каплям при непрерывном перемешивании. Полученная суспензия (сперма+криозащитная среда) разливалась в криопробирки объёмом 1,5 мл, которые сразу или после эквилибрации в течение 0-70 минут устанавливались вертикально на диск из фольгированного гетинакса с отверстиями для пробирок, снабженный датчиком (АТТ-2006, Актаком, Россия), регистрирующим температуру спермы в пробирке. Сперма карповых рыб замораживалась в парах жидкого азота (LN₂) при постепенном погружении диска в криогенную ёмкость с LN₂ по следующей программе: I этап: от +10 до -15^оС со скоростью 1-2^оС/мин; II этап: от -15 до -196^оС с плавно увеличивающейся скоростью до 15-20^оС/мин. В упрощенном протоколе криоконсервации замораживание криопробирок с разбавленной спермой осуществлялось в парах LN₂ на полистироловой рамке с прикрепленной к ней фольгой («плотике»), плавающем на поверхности LN₂ в полистироловом ящике, в течение 10-25минут. После хранения в LN₂ в течение 0,5-3 ч, размораживание пробирок с криоконсервированной спермой проводилось в водном термостате (BIO WB-4Ms, BIOSAN, Латвия) при температурах 30-50^оС в течение 45-75 секунд.

Оценка эффективности использованных экспериментальных криозащитных сред и технологических параметров протоколов проводилась путем определения подвижности и оплодотворяющей способности криоконсервированной спермы. Подвижность оттаявшей спермы, после ее активации 0,1%-ным раствором гидрокарбоната натрия (соды), определялась таким же образом, как подвижность нативной спермы. Оплодотворение икры в лабораторных условиях осуществлялось на чашках Петри в трехкратной повторности. Размороженная сперма, разбавленная активатором в объемном отношении 1:100 (одна пробирка, содержащая 1,5 мл суспензии, т.е. 0,75 мл спермы, на 75 мл активирующего раствора), выливалась на икру (100-150 шт.) при одновременном рассеивании икры колонковой кисточкой по дну чашки. Через 1 мин. икра промывалась водой и помещалась в термостат (MIR-254, SANYO, Япония) для инкубации при температуре 20^оС. Процент оплодотворения определялся на стадии гаструлы. Контролем при оплодотворении служила нативная сперма.

Для приготовления криозащитных сред использовались следующие реактивы: сахароза (SIGMA, США), α-D-глюкоза (SERVA, Германия), инозитол (ACROS ORGANICS, США), метанол (ВЕКТОН, Россия), этиленгликоль, хлорид натрия, хлорид калия (ЛАВЕРНА, Россия).

Расчет доверительных интервалов для средних значений процента развития оплодотворенной икры, при уровне значимости 5%, проводился с помощью надстройки статистического анализа данных MS Excel «Анализ данных».

Результаты и обсуждение

В любой технологии криоконсервирования ключевую роль, в обеспечении сохранения жизнеспособности и оплодотворяющей способности клеток, играет состав используемой криозащитной среды. Поэтому оптимизация протокола криоконсервации спермы карповых рыб, применяемого нами в последние пять лет [1], предполагала вначале выявление наиболее эффективного состава и концентраций компонентов, разработанной ранее, среды, которая в водном растворе 0,1% сахарозы и 0,35% хлорида натрия содержала два проникающих криопротектора: метанол и этиленгликоль в пределах концентраций, соответственно, 20-24% и 3-6% (в массовых долях) [2]. Наиболее высокое защитное действие среды наблюдалось при совместном использовании этих спиртов, что свидетельствовало о проявлении эффекта синергизма. Результаты проведенных опытов по оптимизации состава этой среды, в которых сравнивалось действие конкретных концентраций данных криопротекторов, а также природы и концентраций различных сахаров и солей (выбранных на основании анализа литературных сведений о составе наиболее эффективных разбавителей для спермы карповых рыб [4-6]), сведены в таблицу 1. Действие опытных сред сравнивалось по наиболее достоверному показателю – проценту оплодотворения икры криоконсервированной спермой. Подвижность размороженной спермы, как показатель жизнеспособности клеток в целом, составляющая в среднем 15-30%, не всегда коррелировала как с процентом оплодотворения ею икры, так и с подвижностью нативной спермы.

Таблица 1. Влияние состава криозащитной среды на оплодотворяющую способность размороженной спермы / Table 1. Influence of protective medium composition on post-thawed sperm fertility

В опыте 1 по замораживанию смеси спермы высокого качества, собранной от пяти самцов сазана амурского (подвижность нативной спермы составляла 100%), лучшие результаты оплодотворения икры криоконсервированной спермой (90-91%) были получены при использовании сред с приблизительно одинаковой осмоляльностью, содержащих как 0,35% NaCl, так и 0,3% KCl в растворе 0,1% сахарозы с различными процентными соотношениями метанола и этиленгликоля в вышеупомянутых пределах концентраций (среды №№ 31, 20 и 65). Почти также эффективны (84-89% оплодотворения икры) были подобные среды на основе 3,5% глюкозы. При исключении сахаров из состава растворов, более сильное снижение криозащитного действия наблюдалось для сред, содержащих 0,3% KCl по сравнению с 0,35% NaCl. Удаление и сахаров, и солей приводило к резкому падению криозащитных свойств, что подтверждало необходимость присутствия этих веществ в среде.

Опыт 2 по криоконсервации смеси спермы невысокого качества, собранной от четырех самцов карпа линейного (подвижность нативной спермы составляла около 70%), показал целесообразность увеличения концентрации сахара в среде только в случае отсутствия в ней соли, причем более предпочтительным было присутствие 3,5% сахарозы по сравнению с 3,5% глюкозы. И, в целом, все среды на основе сахарозы проявляли немного более сильные криозащитные свойства, чем их аналоги с теми же концентрациями глюкозы.

В опыте 3, проведенном на индивидуальной сперме двух самцов карпа московского чешуйчатого с подвижностью 100%, было показано отсутствие необходимости в повышении концентрации сахаров в криозащитной среде до 3,5% при замораживании спермы высокого качества. Наиболее высокие степени оплодотворения икры оттаявшей спермой достигались при использовании сред (на основе 0,35% NaCl, 20% метанола и 6% этиленгликоля), содержащих 0,5% сахара, причем более предпочтительно сахарозы (среда № 99), чем глюкозы или инозита.

Небольшое усиление протективного действия сахаров в концентрации 0,5% (по сравнению с концентрацией 1%) в средах и с 0,35% NaCl, и с 0,3% KCl, на основе 20% метанола и 3% этиленгликоля, вновь проявилось в опыте 4 по криоконсервации смеси спермы четырех самцов карпа московского, разбросанного с подвижностью 60%. Кроме того, при использовании той же смеси спермы и среды № 99, было предпринято сравнение двух режимов замораживания: обычного, на диске и на «плотике» в течение 15 мин, которые обеспечили достижение практически одинаковой высокой степени оплодотворения икры оттаявшей спермой (средние значения, соответственно, 86,1% и 84,6%).

В опыте 5 по замораживанию смеси спермы пяти самцов сазана волжского с подвижностью 95% самые высокие результаты оплодотворения икры криоконсервированной спермой (на уровне нативного контроля) обеспечивали сочетания концентраций метанола и этиленгликоля, соответственно, 24% и 6%, а также – 20% и 6%, в средах на основе 0,5% сахара (и сахарозы, и глюкозы), как с 0,35% NaCl, так и с 0,3% KCl. Влияние природы сахаров и солей на успех криоконсервации, в данном случае, нивелировалось при получении в целом высоких показателей по оплодотворению, как это часто происходит при замораживании спермы очень хорошего качества.

Различное влияние хлоридов натрия и калия на криоустойчивость клеток проявилось в опыте 6 по замораживанию смеси спермы двух самцов карпа загорского с подвижностью 50%. Содержание NaCl в концентрациях как 0,15%, так и 0,35% в средах на основе 20% метанола и 6% этиленгликоля, как в присутствии 0,5% сахара (сахарозы или глюкозы), так и без сахаров, обеспечивало в итоге получение существенно более высоких процентов оплодотворения икры оттаявшей спермой, чем содержание KCl в тех же концентрациях. Кроме того, опыт вновь подтвердил целесообразность увеличения концентрации сахара в среде до 3,5% только в случае отсутствия в ней соли.

Выявленная предпочтительность присутствия в криозащитных средах 0,35% NaCl и 0,5% сахара опять проявилась в опыте 7 при замораживании спермы среднего качества (70% подвижных клеток), полученной от сазана амурского. При этом самое высокое протективное действие оказала среда № 99 с концентрацией метанола 20% и концентрацией этиленгликоля 6%.

Это же соотношение концентраций данных криопротекторов было более эффективным по сравнению с соотношением 24% и 6% в средах на основе 0,35% NaCl, при всех испытанных концентрациях (0,1%, 0,5% и 3,5%) как сахарозы, так и глюкозы в опыте 8 по замораживанию смеси спермы шести самцов карпа загорского с подвижностью 65%.

Анализ полученных данных показывает, что самым высоким, стабильным протективным действием на сперму карповых рыб разного качества при замораживании обладает криозащитная среда № 99, содержащая в водном растворе 0,5% сахарозы, 0,35% хлорида натрия, 20% метанола и 6% этиленгликоля.

С использованием этой оптимизированной среды была предпринята проверка эффективности технологических параметров, ранее применяемого протокола криоконсервации спермы карповых рыб [1; 2], а также оценка возможности реализации упрощенного режима замораживания на «плотике», пригодного для экспедиционной работы. Результаты четырех проведенных опытов по отдельным этапам процесса криоконсервации представлены на рисунках 1-4. Опыт 1 проводился на смеси спермы трех самцов сазана амурского с 80% подвижных клеток, опыт 2 – на смеси спермы десяти самцов сазана амурского с подвижностью 75%, опыт 3 – на смеси спермы двух самцов карпа линейного с подвижностью 80%, опыт 4 – на сперме одного самца карпа загорского чешуйчатого с подвижностью 70%.

Сравнение, в обычно применяемом протоколе, различных соотношений разбавления спермы криозащитной средой № 99, при замораживании двух различных смесей спермы сазана амурского и индивидуальной спермы одного самца карпа загорского, в опытах 1, 2 и 4 показало, по результатам оплодотворения икры криоконсервированной спермой, предпочтительность использования соотношения 1:1 (рис. 1).

В тех же опытах, на следующем этапе данного протокола, было подтверждено отсутствие необходимости в длительной (30-70 мин) эквилибрации суспензии сперма+среда, как это и было установлено ранее. Согласно наблюдаемой тенденции, наибольшую оплодотворяющую способность сохраняла сперма, криоконсервированная после эквилибрации в течение 0-10 мин, т.е. заполнение криопробирок должно осуществляться сразу после разбавления спермы средой, без промедления (рис. 2).

Оптимальные технологические параметры этапа оттаивания – температура 40°С и продолжительность 60 сек – оказались такими же, как в обычно применяемом протоколе (рис. 3).

При использовании упрощенного протокола криоконсервации, на «плотике», в этих же опытах была подтверждена избыточность длительной (90-105 мин) эквилибрации суспензии сперма+среда. При продолжительности замораживания от 10 до 20 мин данный протокол обеспечивал сохранение практически такой же оплодотворяющей способности криоконсервированной спермы как при замораживании по двухэтапной программе на диске в обычно применяемом протоколе. При этом прослеживалась тенденция к повышению сохранности клеток при уменьшении времени замораживания до 10 мин (рис. 4).

Дополнительные испытания данного протокола, в сравнении с обычным протоколом замораживания на диске, проведенные на индивидуальной сперме высокого качества от трех самцов карпа загорского, обеспечили достижение практически одинаковой высокой степени оплодотворения икры размороженной спермой и подтвердили достаточность минимального времени замораживания (средние проценты оплодотворения для трех самцов, полученные при замораживании на диске и на «плотике» в течение 10 мин, соответственно, 92,3 и 96,2; 90,7 и 94,5; 91,0 и 92,0).

Рисунок 1. Влияние соотношения разбавления спермы средой на результаты криоконсервации (время эквилибрации суспензии сперма+среда 0-5 мин, замораживание на диске, температура оттаивания замороженной спермы – 40°С, время оттаивания – 60 сек). Среда № 99´ содержит в водном растворе 0,375% сахарозы, 0,263% NaCl, 15% метанола и 4,5% этиленгликоля. При разбавлении спермы средой № 99´ в соотношении 1:2 концентрации компонентов в получаемой суспензии сохраняются теми же, что при разбавлении средой № 99 в соотношении 1:1.

Figure 1. Influence of dilution ratio (sperm+protective medium) on cryopreservation results (equilibration time of sperm: protective medium suspension – 0-5 min, freezing on the disk, thawing temperature of frozen sperm – 40°С, thawing time – 60 s). The medium N 99´ is aqueous solution consisting of 0,375% sucrose, 0,263% NaCl, 15% methanol and 4.5% ethylene glycol. By dilution of sperm with medium N 99´ in dilution ratio 1:2, suspension components concentrations are kept the same as by dilution with medium N 99 in dilution ratio 1:1.

Рисунок 2. Влияние времени эквилибрации суспензии сперма+среда на результаты криоконсервации (среда № 99, соотношение разбавления сперма: среда 1:1, замораживание на диске, температура оттаивания замороженной спермы – 40°С, время оттаивания – 60 сек)

Figure 2. Influence of equilibration time of sperm+protective medium suspension on cryopreservation results (medium N 99, dilution ratio sperm: protective medium 1:1, freezing on the disk, thawing temperature of frozen sperm – 40°С, thawing time – 60 s)

Рисунок 3. Влияние режима оттаивания на результаты криоконсервации (среда № 99, соотношение разбавления сперма: среда 1:1, время эквилибрации суспензии сперма+ среда 0-5 мин, замораживание на диске)

Figure 3. Influence of thawing regime on cryopreservation results (medium N 99, dilution ratio sperm: protective medium 1:1, equilibration time of sperm+protective medium suspension – 0-5 min, freezing on the disk)

Рисунок 4. Влияние параметров замораживания на «плотике» на результаты криоконсервации (среда № 99, соотношение разбавления сперма: среда 1:1, температура оттаивания замороженной спермы – 40°С, время оттаивания – 60 сек)

Figure 4. Influence of parameters of «raft»-freezing on cryopreservation results (medium N 99, dilution ratio sperm: protective medium 1:1, thawing temperature of frozen sperm – 40°С, thawing time – 60 s)

В опытах 1, 2 и 4, проведенных на сперме среднего качества, удалось установить различия во влиянии рассмотренных технологических параметров на успех криоконсервации. В опыте 3, при замораживании спермы высокого качества, эти различия были нивелированы в условиях сохранения криоконсервированной спермой такой же оплодотворяющей способности, как у нативной спермы в контроле. Тем не менее, полученные в этом опыте результаты послужили подтверждением эффективности действия оптимизированной криозащитной среды.

Эффективность данной среды, при использовании обычно применяемого протокола замораживания на диске, дополнительно иллюстрируют также результаты криоконсервации образцов спермы карповых рыб для пополнения коллекции криобанка (табл. 2).

Таблица 2. Оценка качества образцов спермы карповых рыб, криоконсервированных в среде № 99, перед закладкой в криобанк / Table 2. Estimation of quality of cyprinids sperm samples cryopreserved with medium N 99 before putting in cryobank